La e-mail è inviata dal dottor Adam Gaertner, l’11 marzo 2020.
Ciao Anthony,
Ecco come è stato creato il virus
Fusione Intervirion. HIV-luc (ACE2) (500 ng ofp24) è stato miscelato con 1.000 ng di p24 di particelle HIV-gfp che incorporano l’involucro ASLV-A, la proteina SARS-CoVS o entrambi gli inviluppi in PBS a 4° C per 30 minuti per consentire il legame. I campioni sono stati portati a 37°C per 15 minuti per consentire riarrangiamenti conformazionali.
I virioni sono stati regolati al pH desiderato con acido citrico 0,1 M. È stato quindi aggiunto PBS, TPCK-tripsina (concentrazione finale 10 ~ tg/ml), CTSL, catepsina B (CTSB) (concentrazioni finali 2 ~ tg/ml) o tampone CTSL da solo. Il CTSL ricombinante (R & D Systems) è stato preattivato mediante incubazione per 15 min a 10 µg/ml in 50 mM Mes, pH 6,0, su ghiaccio.
Il CTSB ricombinante (R & D Systems) è stato preattivato in 25 mMMes, 5 mM OTT, pH 5,0, per 30 minuti a 25°C. Dopo un’incubazione di 10 minuti a 25°C, la proteolisi è stata interrotta mediante l’aggiunta di 300 µl di DMEMIO contenente leupept in (25 µg/ml) e STI (75 µg/ml).
I virioni sono stati quindi incubati a 37°C per 30 minuti per consentire la fusione della membrana. 100 µl della miscela di virione sono stati aggiunti in quadruplicato a cellule HeLa-Tva pretrattate per 1 ora con leupeptina (20 ~ tg/ml). Le cellule sono state infettate con spin e incubate a 37° C per 5 h.
